分光光度計的設計原理和工作原理

　　事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高(超過光度計的測試范圍)。zui后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值;混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的zui小體積等多個操作事項。

　　除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

　　蛋白質的直接定量(UV法)

　　這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示 出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩(wěn)定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

　　比色法蛋白質定量

　　蛋白質通常是多種蛋白質的混合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質濃度。